多肽合成方法

　　多肽合成方法：
 

　　1.酰基疊氮物法
 

　　早在1902年，Theodor Curtius就將酰基疊氮物法引入到肽化學中，因此它是最古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中，除了與酰基疊氨縮合的游離氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有機溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是，它不需要增加輔助堿或另一等當量的氨基組分來捕獲腙酸。
 

　　長期以來，一直認為疊氮物法是不發(fā)生消旋的縮合方法，隨著可選擇性裂解的氨基酸保護基引入，該方法經歷了一次大規(guī)模的復興。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應的酯很容易得到。在-10℃的鹽酸中，用等當量的亞硝酸鈉使酰肼發(fā)生亞硝化而轉化為疊氮化物65,依次洗滌、干燥，然后與相應的氨基組分反應。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來。 二苯磷?；B氮化物(DPPA)也可以用于?；B氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑，并且使疊氮縮合反應可在有機溶劑中進行。因?；B氮化物的熱不穩(wěn)定性，縮合反應需在低溫下進行。當溫度較高時，Curtius重排，即?；B氮轉化為異氰酸酯的反應成為一個主要的副反應，最終導致生成副產物脲。由于反應溫度低(如4℃)而導致反應速率相當慢，使得肽縮合反應通常需要幾天才能*。  對于較長的N端保護的肽鏈，酯基的肼解一般比較困難，因此，使用正交的N保護肼衍生物是一種選擇。在肼基的選擇性脫除后，按倒接(backing-off)策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合。
 

　　如前所述，雖然疊氮法一直被認為是消旋化傾向最小的縮合方法，但在反應中，過量的堿會誘發(fā)相當大的消旋。因此，在縮合反應期間要避免與堿接觸，例如，氨基組分的銨鹽應采用N，N-二異丙胺或N-烷基嗎啉代替三乙胺來中和。
 

　　雖然有上述局限性，但該方法仍很重要，尤其對于片段縮合而言，因為該方法具有較低的異構化傾向，適用于羥基未保護絲氨酸或蘇氨酸組分時，Nˊ保護的本行酰肼還具有多種用途。
 

　　2.酸酐法
 

　　在多肽合成中，最初考慮應用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius對苯甲?；被宜岷铣傻脑缙谘芯?。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應中，除獲得苯甲酰氨基乙酸外，還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認為，當用苯甲酰氯處理時，N-苯甲?；被峄騈-苯甲?；呐c苯甲酸形成了活性中間體不對稱酸酐。  大約在70年后，Theodor Wieland利用這些發(fā)現將混合酸酐法用于現代多肽合成。目前，除該方法外，對稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內形成的N-羧基內酸酐(NCA,Leuchs anhydrides)也用肽縮合。最后應該提到，不對稱酸酐常常參與生化反應中的?；磻?br /> 

　　3.混合酸酐法
 

　　有機羧酸和無機酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，僅有幾個得到了廣泛的實際應用，多數情況下，采用氯甲酸烷基酯。
 

　　由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反應的區(qū)域選擇性依賴依賴于兩個互相競爭的羰基的親電性和(或)空間位阻。在由N保護的氨基酸羧酸鹽(羧基組分)和氯甲酸烷基酯(活化組分，例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐時，親核試劑胺主要進攻氨基酸組分的羧基，形成預期的肽衍生物，并且釋放出游離酸形式的活性成分。當應用氯甲酸烷基酯(R1=異丁基、乙基等)時，游離的單烷基碳酸不穩(wěn)定，立即分解為二氧化碳和相應的醇。然而，對于親核進攻的區(qū)域選擇性，也有一些相反的報道，產物為氨基甲酸酯和原來的N保護氨基酸組分。  為了形成混合酸酐，將N保護的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等當量的三級堿(N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉等)處理。然后，在-15℃--5℃，劇烈攪拌的同時加入氯甲酸烷基酯以形成不對稱酸酐(活化)。經短時間活化后，加入親核性氨基酸組分。如果作為銨鹽使用(需要更多的堿)，必須避免堿的過量使用。如果嚴格按照以上的反應條件，混合酸酐法很容易進行，是*的縮合方法之一。
 

　　4.對稱酸酐法
 

　　Nα-?；被岬膶ΨQ酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法相反，它與胺親核試劑的反應沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性。但肽縮合產率最高，為50%(以羧基組分計)。
 

　　雖然由對稱酸酐氨解形成的游離Nα-?；被峥梢院湍繕穗囊黄穑ㄟ^飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收，但在最初，這種方法的實用價值極低。對稱酸酐可以用Nα-保護氨基酸與光氣，或方便的碳二亞胺反應制得。兩當量的Nα-保護氨基酸與-當量的碳二亞胺反應有利于對稱酸酐的形成，對稱酸酐可以分離出來，也可不經純化而直接用于后面的縮合反應?；贜α-烷氧羰基氨基酸的對稱酸酐對水解穩(wěn)定，可采用類似上述純化混合酸酐的方法進行純化。
 

　　由于Boc-保護氨基酸的商品化和合理的價格，在肽鏈的逐步延長中，使用對稱酸酐法日益受到重視。雖然可以買到晶狀的對稱酸酐，但原位制備仍然是一種不錯的選擇。
 

　　5.碳二亞胺法
 

　　碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合。在該類化合物中N，Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對便宜，而且可溶于肽合成常用的溶劑。在肽鍵形成期間，碳二亞胺轉變?yōu)橄鄳碾逖苌?，N，Nˊ-二環(huán)己基脲可以從反應液中沉淀出來。顯然，碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介質進行。經幾個課題組的大量研究，確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合反應機理，羧酸根離子加成到質子化的碳二亞胺，形成高活性的O-?；澹浑m然還沒有分離出這個中間體，但通過非常類似的穩(wěn)定化合物推斷了它的存在。O-?；迮c氨基組分反應，產生被保護的肽和脲衍生物?；蛘?，與質子化形式處于處于平衡狀態(tài)的O-?；愲?被第二個羧酸酯親核進攻，產生對稱的氨基酸酐和N，Nˊ-二取代脲。前者與氨基酸反應得到肽衍生物和游離氨基酸。在堿催化下，使用DCC的副反應使酰基從異脲氧原子向氮原子轉移，產生N-?；?1,它不再發(fā)生進一步的氨解。不僅過量的堿可催化O-N的?；D移，而且堿性的氨基組分或碳二亞胺也可催化該副反應。